纯化线粒体氧化应激活性氧（ROS）高质荧光测定试剂盒产品说明书

HEPENGBIO纯化线粒体氧化应激活性氧（ROS）高质荧光测定试剂盒产品说明书
 
主要用途
 
HEPENGBIO纯化线粒体氧化应激活性氧（ROS）高质荧光测定试剂是一种旨在通过透膜荧光染色剂氯甲基二氯二氢荧光素二乙酯，在线粒体氧化条件下，产生荧光，来定量检测线粒体内活性氧族的生成和增加的方法。可以被用于细胞凋亡、信号传递、衰老、代谢和营养学等的研究。产品严格无菌，即到即用，操作简易，活体检测，性能稳定。
 
技术背景
 
超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基（hydroxyl radical；OH-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、单线态氧气（singlet oxygen）等细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡。氯甲基二氯二氢荧光素二乙酯（6-chloromethyl-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester；CM-H2DCFDA）是取代二氯二氢荧光素二乙酯（2´,7´-dichlorodihydrofluorescin diacetate；DCFH-DA）的升级产品，一种完全自由通过细胞膜，并在细胞内长期滞留而不易外漏的染色剂。一旦被过氧化氢、羟自由基或氢氧基、过氧化基、次氯酸等氧化，便产生荧光。据此测定线粒体活性氧族的浓度。
 
产品内容
 
HEPENGBIO缓冲液（Reagent A）      3毫升
HEPENGBIO补充液（Reagent B）      3毫升
HEPENGBIO染色液（Reagent C）     40微升
产品说明书 1份
 
保存方式
 
保存在－20℃冰箱里，HEPENGBIO染色液（Reagent C），严格避免光照；有效保证6月
 
用户自备
 
黑色96孔板：用于样品操作的容器
培养箱：用于染色孵育
（共聚焦）荧光显微镜：用于观察荧光线粒体
荧光酶标仪：用于测定线粒体荧光强度
 
实验步骤
 
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂放进冰槽里融化，避免光照；同时从－80℃冰箱里取出待测的线粒体，放进冰槽里融化。然后进行下列操作。
1． 准备1个黑色96孔板，标记好背景对照孔和待测样品孔
2． 分别加入150微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent A）
3． 移取50微升线粒体悬液（总量为50微克线粒体蛋白）到黑色96孔板的相应待测样品孔里
4． 加入50微升HEPENGBIO补充液（Reagent B）到黑色96孔板的相应背景对照孔里
5． 分别加入2微升HEPENGBIO染色液（Reagent C）到上述孔里
6． 放进37℃培养箱里孵育15分钟，避免光照
7． 选择下列方式之一进行操作：
a) 使用（共聚焦）荧光显微镜观察（定性检测）：
1）移取10微升上述悬液到载波片上，盖上盖玻片
2）激发波长490nm，散发波长530nm――
绿色荧光增强，表明活性氧族（ROS）含量高
 
b) 或使用荧光酶标仪检测（定量检测）：
1）直接放进荧光酶标仪：激发波长490nm，散发波长530nm――
样品RFU－对照RFU＝实际线粒体RFU：增高，表明活性氧族（ROS）含量高
 
注意事项
 
1． 本产品为20次操作
2． 操作时，须戴手套
3． 孵育时，须避免光照
4． 建议染色完成后，即刻进行荧光分析
5． 本公司提供膜电位或呼吸链依赖性活性氧检测试剂产品
6． 本公司提供系列活性氧检测试剂产品
 
质量标准
 
1． 本产品经鉴定性能稳定
本产品经鉴定荧光清晰