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线粒体细胞器的分离是现代细胞生物学研究的最常用的手段之一。从任何组织或细胞分离线粒体的方法基本上采用：第一，通过机械或化学方法破裂细胞；第二，通过低速差速离心去除残渣碎屑和巨大细胞器；第三，通过高速差速离心获得线粒体；甚至，第四，可以通过等密度离心获得纯度更高的线粒体。
产品内容
HEPENGBIO清理液（Reagent A） 100毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B） 40毫升
HEPENGBIO净化液（Reagent C） 10毫升
HEPENGBIO强化液（Reagent D） 5毫升
HEPENGBIO保存液（Reagent E） 100毫升
产品说明书 1份
保存方式
保存HEPENGBIO净化液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月
用户自备
HANK平衡盐缓冲溶液（HPBIO12028）或PBS缓冲溶液（HPBIO12033）：用于清理细胞
胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（HPBIO12024）：用于细胞脱离
完全细胞培养液（HPBIO12052）：用于细胞处理所需的培养基
15毫升锥形离心管：用于线粒体初步制备物的存放
50毫升锥形离心管：用于细胞或组织收集后离心或清洗
1.5毫升离心管：用于保存线粒体
4℃台式离心机：用于沉淀细胞
4℃超速离心机：用于分离细胞器成分
DOUNCE匀浆器：用于裂解细胞
实验步骤
一、 动物软组织线粒体分离（组织匀浆法）
实验开始前，将－20℃冰箱里的HEPENGBIO净化液（Reagent C）取出冻融，然后移出1毫升HEPENGBIO净化液（Reagent C）和4毫升的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为HEPENGBIO裂解工作液，放进冰槽里备用。然后进行下列操作。
1． 手术取出动物组织，并秤重以确定1克组织重量（实验前最好使动物空腹12至24小时）
2． （选择步骤）放进预冷的50毫升锥形离心管
3． （选择步骤）加入5毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A）清洗1次
4． 即刻用刀片切碎组织
5． 放进一个预冷的15毫升锥形离心管
6． 加入5毫升预冷的HEPENGBIO裂解工作液
7． 涡旋震荡5秒，充分混匀
8． 即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器
9． 在冰槽里用匀浆棒匀化组织（约20至40下）（注意：参见注意事项8）
10． 将所有组织匀浆物移入15毫升锥形离心管
11． 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
12． 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
13． 放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
14． 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
（注意：如果进行线粒体DNA萃取，直接进入HEPENGBIO线粒体DNA萃取试剂盒的步骤4，继续下去）
15． （选择步骤）加入3毫升预冷的HEPENGBIO保存液（Reagent E）
16． （选择步骤）放进4℃超速离心机再次离心5分钟，速度为10000g
17． （选择步骤）小心抽去上清液
18． 加入1毫升HEPENGBIO保存液（Reagent E），充分混匀
19． 即刻移入1.5毫升离心管，放进－70℃冰箱里
二、动物软组织线粒体分离（化学处理法）
实验开始前，将－20℃冰箱里的HEPENGBIO净化液（Reagent C）取出冻融，然后移出1毫升HEPENGBIO净化液（Reagent C）和4毫升的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为HEPENGBIO裂解工作液，放进冰槽里备用。然后进行下列操作。
1． 手术取出动物组织，并秤重以确定1克组织重量（实验前最好使动物空腹12至24小时）
2． （选择步骤）放进预冷的50毫升锥形离心管
3． （选择步骤）加入5毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A）清洗1次
4． 移入一个液氮冻存管
5． 即刻放入液氮罐过夜
6． 次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）碾碎组织成粉末（注意：切莫使组织冻融）
7． 放进一个15毫升锥形离心管
8． 加入5毫升预冷的HEPENGBIO裂解工作液
9． 涡旋震荡5秒，充分混匀
10． 在冰槽里孵育2分钟，期间涡旋震荡5秒一次
11． 加入500微升预冷的HEPENGBIO强化液（Reagent D）
12． 涡旋震荡5秒，充分混匀
13． 在冰槽里孵育5分钟，期间涡旋震荡5秒二次（注意：参见注意事项9）
14． 加入5毫升预冷的HEPENGBIO保存液（Reagent E），轻轻摇动试管混匀
15． 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
16． 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
17． 放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
18． 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
（注意：如果进行线粒体DNA萃取，直接进入HEPENGBIO线粒体DNA萃取试剂盒的步骤4，继续下去）
19． （选择步骤）加入3毫升预冷的HEPENGBIO保存液（Reagent E）
20． （选择步骤）放进4℃超速离心机再次离心5分钟，速度为10000g
21． （选择步骤）小心抽去上清液
22． 加入1毫升HEPENGBIO保存液（Reagent E），充分混匀
23． 即刻移入1.5毫升离心管，放进－70℃冰箱里
三、动物细胞线粒体分离（细胞匀浆法）
实验开始前，将－20℃冰箱里的HEPENGBIO净化液（Reagent C）取出冻融，然后移出1毫升HEPENGBIO净化液（Reagent C）和4毫升的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为HEPENGBIO裂解工作液，放进冰槽里备用。然后进行下列操作。
1． 准备5至10瓶75cm2细胞培养瓶的细胞（5 X 107），直至细胞生长铺满整个培养表面
2． 分别加入10毫升用户自备的HANK平衡盐缓冲溶液或PBS缓冲溶液到每个细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面，然后抽去
3． 重复实验步骤2一次
4． 加入3毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个细胞生长表面
5． 置入37℃培养箱3分种
6． 轻轻手击震动培养瓶，使细胞脱落，
7． 分别加入10毫升用户自备的完全细胞培养液
8． 移入一个50毫升锥形离心管
9． 放进台式离心机离心10分钟，速度为200g
10． 小心抽去上清液
11． 加入10毫升预冷的HEPENGBIO清理液（Reagent A），混匀细胞
12． 放进台式离心机离心10分钟，速度为300g
13． 小心抽去上清液
14． 加入5毫升预冷的HEPENGBIO裂解工作液
15． 涡旋震荡5秒，充分混匀细胞颗粒群
16． 即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器
17． 在冰槽里用匀浆棒匀化细胞（约20至40下）（注意：参见注意事项8）
18． 将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管
19． 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
20． 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
21． 放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
22． 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
（注意：如果进行线粒体DNA萃取，直接进入HEPENGBIO线粒体DNA萃取试剂盒的步骤4，继续下去）
23． （选择步骤）加入3毫升预冷的HEPENGBIO保存液（Reagent E）
24． （选择步骤）放进4℃超速离心机再次离心5分钟，速度为10000g
25． （选择步骤）小心抽去上清液
26． 加入1毫升HEPENGBIO保存液（Reagent E），充分混匀
27． 即刻移入1.5毫升离心管，放进－70℃冰箱里
四、动物细胞线粒体分离（化学处理法）
实验开始前，将－20℃冰箱里的HEPENGBIO净化液（Reagent C）取出冻融，然后移出1毫升HEPENGBIO净化液（Reagent C）和4毫升的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为HEPENGBIO裂解工作液，放进冰槽里备用。然后进行下列操作。
1． 准备5至10瓶75cm2细胞培养瓶的细胞（5 X 107），直至细胞生长铺满整个培养表面
2． 分别加入10毫升用户自备的HANK平衡盐缓冲溶液或PBS缓冲溶液到每个细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面，然后抽去
3． 重复实验步骤2一次
4． 加入3毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个细胞生长表面
5． 置入37℃培养箱3分种
6． 轻轻手击震动培养瓶，使细胞脱落
7． 分别加入10毫升用户自备的完全细胞培养液
8． 移入一个50毫升锥形离心管
9． 放进台式离心机离心10分钟，速度为200g
10． 小心抽去上清液
11． 加入10毫升预冷的HEPENGBIO清理液（Reagent A）
12． 放进台式离心机离心10分钟，速度为300g
13． 小心抽去上清液
14． 加入5毫升预冷的HEPENGBIO裂解工作液
15． 涡旋震荡5秒，充分混匀
16． 在冰槽里孵育2分钟，期间涡旋震荡5秒一次
17． 加入500微升预冷的HEPENGBIO强化液（Reagent D）
18． 涡旋震荡5秒，充分混匀
19． 在冰槽里孵育5分钟，期间涡旋震荡5秒二次（注意：参见注意事项9）
20． 加入5毫升预冷的HEPENGBIO保存液（Reagent E），轻轻摇动试管混匀
21． 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
22． 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
23． 放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
24． 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
（注意：如果进行线粒体DNA萃取，直接进入HEPENGBIO线粒体DNA萃取试剂盒的步骤4，继续下去）
25． （选择步骤）加入3毫升预冷的HEPENGBIO保存液（Reagent E）
26． （选择步骤）放进4℃超速离心机再次离心5分钟，速度为10000g
27． （选择步骤）小心抽去上清液
28． 加入1毫升HEPENGBIO保存液（Reagent E），充分混匀
29． 即刻移入1.5毫升离心管，放进－70℃冰箱里
产品内容
HEPENGBIO清理液（Reagent A） 100毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B） 40毫升
HEPENGBIO净化液（Reagent C） 10毫升
HEPENGBIO强化液（Reagent D） 5毫升
HEPENGBIO保存液（Reagent E） 100毫升
产品说明书 1份
保存方式
保存HEPENGBIO净化液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月
用户自备
HANK平衡盐缓冲溶液（HPBIO12028）或PBS缓冲溶液（HPBIO12033）：用于清理细胞
胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（HPBIO12024）：用于细胞脱离
完全细胞培养液（HPBIO12052）：用于细胞处理所需的培养基
15毫升锥形离心管：用于线粒体初步制备物的存放
50毫升锥形离心管：用于细胞或组织收集后离心或清洗
1.5毫升离心管：用于保存线粒体
4℃台式离心机：用于沉淀细胞
4℃超速离心机：用于分离细胞器成分
DOUNCE匀浆器：用于裂解细胞
实验步骤
一、 动物软组织线粒体分离（组织匀浆法）
实验开始前，将－20℃冰箱里的HEPENGBIO净化液（Reagent C）取出冻融，然后移出1毫升HEPENGBIO净化液（Reagent C）和4毫升的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为HEPENGBIO裂解工作液，放进冰槽里备用。然后进行下列操作。
1． 手术取出动物组织，并秤重以确定1克组织重量（实验前最好使动物空腹12至24小时）
2． （选择步骤）放进预冷的50毫升锥形离心管
3． （选择步骤）加入5毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A）清洗1次
4． 即刻用刀片切碎组织
5． 放进一个预冷的15毫升锥形离心管
6． 加入5毫升预冷的HEPENGBIO裂解工作液
7． 涡旋震荡5秒，充分混匀
8． 即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器
9． 在冰槽里用匀浆棒匀化组织（约20至40下）（注意：参见注意事项8）
10． 将所有组织匀浆物移入15毫升锥形离心管
11． 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
12． 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
13． 放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
14． 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
（注意：如果进行线粒体DNA萃取，直接进入HEPENGBIO线粒体DNA萃取试剂盒的步骤4，继续下去）
15． （选择步骤）加入3毫升预冷的HEPENGBIO保存液（Reagent E）
16． （选择步骤）放进4℃超速离心机再次离心5分钟，速度为10000g
17． （选择步骤）小心抽去上清液
18． 加入1毫升HEPENGBIO保存液（Reagent E），充分混匀
19． 即刻移入1.5毫升离心管，放进－70℃冰箱里
二、动物软组织线粒体分离（化学处理法）
实验开始前，将－20℃冰箱里的HEPENGBIO净化液（Reagent C）取出冻融，然后移出1毫升HEPENGBIO净化液（Reagent C）和4毫升的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为HEPENGBIO裂解工作液，放进冰槽里备用。然后进行下列操作。
1． 手术取出动物组织，并秤重以确定1克组织重量（实验前最好使动物空腹12至24小时）
2． （选择步骤）放进预冷的50毫升锥形离心管
3． （选择步骤）加入5毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A）清洗1次
4． 移入一个液氮冻存管
5． 即刻放入液氮罐过夜
6． 次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）碾碎组织成粉末（注意：切莫使组织冻融）
7． 放进一个15毫升锥形离心管
8． 加入5毫升预冷的HEPENGBIO裂解工作液
9． 涡旋震荡5秒，充分混匀
10． 在冰槽里孵育2分钟，期间涡旋震荡5秒一次
11． 加入500微升预冷的HEPENGBIO强化液（Reagent D）
12． 涡旋震荡5秒，充分混匀
13． 在冰槽里孵育5分钟，期间涡旋震荡5秒二次（注意：参见注意事项9）
14． 加入5毫升预冷的HEPENGBIO保存液（Reagent E），轻轻摇动试管混匀
15． 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
16． 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
17． 放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
18． 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
（注意：如果进行线粒体DNA萃取，直接进入HEPENGBIO线粒体DNA萃取试剂盒的步骤4，继续下去）
19． （选择步骤）加入3毫升预冷的HEPENGBIO保存液（Reagent E）
20． （选择步骤）放进4℃超速离心机再次离心5分钟，速度为10000g
21． （选择步骤）小心抽去上清液
22． 加入1毫升HEPENGBIO保存液（Reagent E），充分混匀
23． 即刻移入1.5毫升离心管，放进－70℃冰箱里
三、动物细胞线粒体分离（细胞匀浆法）
实验开始前，将－20℃冰箱里的HEPENGBIO净化液（Reagent C）取出冻融，然后移出1毫升HEPENGBIO净化液（Reagent C）和4毫升的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为HEPENGBIO裂解工作液，放进冰槽里备用。然后进行下列操作。
1． 准备5至10瓶75cm2细胞培养瓶的细胞（5 X 107），直至细胞生长铺满整个培养表面
2． 分别加入10毫升用户自备的HANK平衡盐缓冲溶液或PBS缓冲溶液到每个细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面，然后抽去
3． 重复实验步骤2一次
4． 加入3毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个细胞生长表面
5． 置入37℃培养箱3分种
6． 轻轻手击震动培养瓶，使细胞脱落，
7． 分别加入10毫升用户自备的完全细胞培养液
8． 移入一个50毫升锥形离心管
9． 放进台式离心机离心10分钟，速度为200g
10． 小心抽去上清液
11． 加入10毫升预冷的HEPENGBIO清理液（Reagent A），混匀细胞
12． 放进台式离心机离心10分钟，速度为300g
13． 小心抽去上清液
14． 加入5毫升预冷的HEPENGBIO裂解工作液
15． 涡旋震荡5秒，充分混匀细胞颗粒群
16． 即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器
17． 在冰槽里用匀浆棒匀化细胞（约20至40下）（注意：参见注意事项8）
18． 将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管
19． 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
20． 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
21． 放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
22． 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
（注意：如果进行线粒体DNA萃取，直接进入HEPENGBIO线粒体DNA萃取试剂盒的步骤4，继续下去）
23． （选择步骤）加入3毫升预冷的HEPENGBIO保存液（Reagent E）
24． （选择步骤）放进4℃超速离心机再次离心5分钟，速度为10000g
25． （选择步骤）小心抽去上清液
26． 加入1毫升HEPENGBIO保存液（Reagent E），充分混匀
27． 即刻移入1.5毫升离心管，放进－70℃冰箱里
四、动物细胞线粒体分离（化学处理法）
实验开始前，将－20℃冰箱里的HEPENGBIO净化液（Reagent C）取出冻融，然后移出1毫升HEPENGBIO净化液（Reagent C）和4毫升的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为HEPENGBIO裂解工作液，放进冰槽里备用。然后进行下列操作。
1． 准备5至10瓶75cm2细胞培养瓶的细胞（5 X 107），直至细胞生长铺满整个培养表面
2． 分别加入10毫升用户自备的HANK平衡盐缓冲溶液或PBS缓冲溶液到每个细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面，然后抽去
3． 重复实验步骤2一次
4． 加入3毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个细胞生长表面
5． 置入37℃培养箱3分种
6． 轻轻手击震动培养瓶，使细胞脱落
7． 分别加入10毫升用户自备的完全细胞培养液
8． 移入一个50毫升锥形离心管
9． 放进台式离心机离心10分钟，速度为200g
10． 小心抽去上清液
11． 加入10毫升预冷的HEPENGBIO清理液（Reagent A）
12． 放进台式离心机离心10分钟，速度为300g
13． 小心抽去上清液
14． 加入5毫升预冷的HEPENGBIO裂解工作液
15． 涡旋震荡5秒，充分混匀
16． 在冰槽里孵育2分钟，期间涡旋震荡5秒一次
17． 加入500微升预冷的HEPENGBIO强化液（Reagent D）
18． 涡旋震荡5秒，充分混匀
19． 在冰槽里孵育5分钟，期间涡旋震荡5秒二次（注意：参见注意事项9）
20． 加入5毫升预冷的HEPENGBIO保存液（Reagent E），轻轻摇动试管混匀
21． 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
22． 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
23． 放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
24． 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
（注意：如果进行线粒体DNA萃取，直接进入HEPENGBIO线粒体DNA萃取试剂盒的步骤4，继续下去）
25． （选择步骤）加入3毫升预冷的HEPENGBIO保存液（Reagent E）
26． （选择步骤）放进4℃超速离心机再次离心5分钟，速度为10000g
27． （选择步骤）小心抽去上清液
28． 加入1毫升HEPENGBIO保存液（Reagent E），充分混匀
29． 即刻移入1.5毫升离心管，放进－70℃冰箱里
