凝血酶（THROMBIN；EC3.4.21.5），又称为活化因子IIa（Activated Factor Iia），属于丝氨酸蛋白酶，存在于血液循环中的凝血蛋白。其原酶分子量是72kd，由活化因子Xa（Activated Factor Xa）所切离产生的活化凝血酶分子量是36kd。其功能在于将血浆中可溶性纤维蛋白原（fibrinogen）转化为不溶性纤维蛋白凝块（fibrin clot），活化因子XI、V、VIII，XIII等，以及促进血小板聚集等凝血机制方面发挥重要作用。凝血酶影响一系列正常和病理反应，包括炎症、组织修复、胚胎形成、血管形成、肿瘤浸润等。凝血酶基因突变将导致血栓形成（thrombosis）。凝血酶的目标蛋白切离部位为Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser。尿激酶的抑制剂是苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonyl fluoride；PMSF）。基于人工合成的多肽化合物底物H-D-Phe-Pip- Arg-pNA（HD-苯丙氨酰- pipecolyl-精氨酰对硝基苯胺）受到凝血酶的水解，释放有色对硝基苯胺，在分光光度仪（405nm 波长）下，测定吸光峰值的变化，来定量测定凝血酶的活性。其反应系统为：
 
 
产品内容
 
HEPENGBIO缓冲液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO阴性液（Reagent B）   毫升
HEPENGBIO底物液（Reagent C）   微升
产品说明书    1份
 
保存方式
 
保存在-20℃冰箱里；HEPENGBIO底物液（Reagent C）避免光照和反复冻融；有效保证6月
 
用户自备
 
1.5毫升离心管：用于样品制备和储存的容器
微型台式离心机：用于样品沉淀
培养箱：用于反应物孵育
酶标板或比色皿：用于样品比色测定的容器
酶标仪或分光光度仪：用于样品比色分析
 
实验步骤
  
一、 样品制备
 
1． 准备好肝素或ACD抗凝管（注意：避免使用EDTA抗凝管）
2． 抽取1毫升血液，置于抗凝管里
3． 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
4． 小心移取上层黄色液体到新的1.5毫升离心管――此为血浆成分（注意：避免触碰白色液体层）
5． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用HEPENGBIO Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－HEPENGBIO30030.1）
6． 即刻置于冰槽里备用或放进－70℃冰箱里保存
 
二、 测定准备
 
1． 准备好上述制备的待测样品
2． 设定好酶标仪（温度为37℃）：波长405nm，并置零
3． 实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的HEPENGBIO底物液（Reagent C）置入冰槽里融化，避免光照。HEPENGBIO缓冲液（Reagent A）室温下均衡温度
 
三、 活性测定
 
1． 在96孔酶标板上做好相应标记：背景对照和样品
2． 分别移取xx微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent A）到相应孔中
3． 分别加入xx微升HEPENGBIO阴性液（Reagent B）或上述制备的待测样品（50微克蛋白）到相应孔中（注意：样品须清澈）
4． 分别加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent C）
5． 轻轻摇动96孔酶标板（注意：避免气泡）
6． 在37℃温度下孵育60分钟（注意：可见反应孔里呈现肉眼可见的黄色）
7． 即刻放进酶标仪检测或转移到100微升比色皿，在分光光度仪里检测
8． 活性计算：
 
（1） 酶标仪检测
 
 
（2） 比色皿检测
 
 
注意事项
 
1． 本产品为21次操作，包括背景对照
2． 操作时，须戴手套
3． 系统操作过程中，背景测定只需1次
4． 样品须澄清，且避免反复冻融
5． 测定值由低到高变化；测定可持续60分钟
6． 比色测定后，比色皿须清洗彻底
7． 样本测定60分钟读数高于0分钟读数表明具有酶活性
8． 建议待测样本蛋白浓度为50微克/5微升（本公司提供 HEPENGBIO Bradford蛋白质浓度定量试剂盒HEPENGBIO30030.1）
9． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
10． 可以使用凝血酶抑制剂，N-α-NAPAP，作为抑制剂对照或阴性对照
11． 凝血酶单位活性定义为：在37℃，pH 7..5条件下，每分钟内能够切离1微摩尔多肽化合物底物H-D-Phe-Pip- Arg-pNA所需的酶量作为一个活性单位
本试剂盒只能用于科学研究，不得用于医学诊断或其他用途。