糖胺多糖（glycosaminoglycan；GAG），又称为粘多糖（mucopolysaccharide），是体内最为丰富的异源多聚糖。糖胺多糖是一种未分叉的负电荷性长链多聚糖，由重复的二糖单位，包括六碳糖（hexose）或己糖醛酸（hexuronic acid），链接到己糖胺（hexoamine）上而成。糖胺多糖与核心蛋白（core protein）共价相联，构成蛋白多糖（proteoglycan；PG），成为细胞膜和细胞外基质（extracellular matrix；ECM）的主要成分。蛋白多糖的糖胺多糖在合成过程中发生硫酸酯化（sulfated group），其部位在O或N位上，有利于发挥各种不同的作用，包括酶的调节、细胞黏附、生长、迁移、分化，以及组织损伤反应。基于糖胺多糖的高度负电荷的特点，使用异染性（metachromatic）阳离子蓝色染料二甲基亚甲基蓝（1,9-dimethylmethylene blue；DMMB），在酸性条件下，特异性的结合产生不溶性紫色或粉红色糖胺多糖染料复合物（Dye-GAG complex），在丙醇解离溶液中，释放出染料，通过分光光度仪（656nm波长）测定，来定量分析糖胺多糖的总含量。 
 
产品内容
 
HEPENGBIO清理液（Reagent A）         120毫升
HEPENGBIO萃取液（Reagent B）        20 毫升
HEPENGBIO染色液（Reagent C）   25 毫升
HEPENGBIO解离液（Reagent D）   25 毫升
HEPENGBIO标准液（Reagent E）    100微升
产品说明书    1份
 
保存方式
 
保存HEPENGBIO萃取液（Reagent B）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；HEPENGBIO染色液（Reagent C）避免光照；有效保证3月
 
用户自备
 
1.5毫升离心管：用于样品操作的容器
15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
细胞刮脱棒：用于细胞脱离
恒温水槽或干式恒温仪：用于样品反应
微型台式离心机：用于样品操作
比色皿或96孔板：用于比色分析的容器
分光光度仪或酶标仪：用于比色分析
 
实验步骤
 
一、样品预处理  
 
1． 准备好75cm²细胞培养瓶或100mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 10⁷细胞）
2． 小心加入3毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A），覆盖生长表面
3． 小心抽去清理液
4． 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）
5． 加入3毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A），混匀细胞
6． 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
7． 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
8． 小心抽去上清液
9． 加入500微升HEPENGBIO萃取液（Reagent B）
10． 放进一个1.5毫升离心管
11． 强力涡旋震荡1分钟，充分混匀
12． 放进56℃恒温水槽孵育16小时
13． 放进90℃恒温水槽孵育10分钟
14． 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
15． 小心移取上清液到新的1.5毫升离心管
16． 置于冰槽里备用
 
二、标准样品配制
 
1． 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管
2． 分别加入50微升HEPENGBIO清理液（Reagent A）到1至5号管
3． 移取50微升HEPENGBIO标准液（Reagent E）到1号管，混匀
4． 小心移取50微升1号管稀释的HEPENGBIO标准液（Reagent E）到2号管，混匀
5． 小心移取50微升2号管稀释的HEPENGBIO标准液（Reagent E）到3号管，混匀
6． 小心移取50微升3号管稀释的HEPENGBIO标准液（Reagent E）到4号管，混匀
7． 将1至5号管放进冰槽里备用；标准管浓度见下表
 

管号	HEPENGBIO清理液（Reagent A）	HEPENGBIO标准液（Reagent E）	标准糖胺多糖含量
1	50微升	50微升	5微克
2	50微升	50微升1号管	2.5微克
3	50微升	50微升2号管	1.25微克
4	50微升	50微升3号管	0.625微克
5	50微升	0	0

 
 
三、 标准曲线测定
 
1． 移取50微升上述配制的HEPENGBIO标准液（Reagent E）到1.5毫升离心管
2． 加入1毫升HEPENGBIO染色液（Reagent C）
3． 涡旋震荡15秒
4． 室温下孵育30分钟，避免光照，期间每隔5分钟涡旋震荡15秒
5． 即刻放进微型台式离心机离心10分钟，速度为16000g
6． 小心抽去上清液（注意：确保没有水滴残留）（注意：可见紫色或粉红色沉淀）
7． 加入1毫升HEPENGBIO解离液（Reagent D）
8． 涡旋震荡15秒
9． 室温下孵育5分钟，避免光照（注意：确保充分溶解）
10． 转移到新的比色皿
11． 即刻放进分光光度仪检测（波长656nm）：获得标准样品吸光读数
12． 重复实验步骤1至11四次
13． 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为吸光读数；横座标（X轴）为标准糖胺多糖含量（微克）
 
四、 样品测定
 
1． 加入50微升上述制备的待测样品到1.5毫升离心管
2． 加入1毫升HEPENGBIO染色液（Reagent C）
3． 涡旋震荡15秒
4． 室温下孵育30分钟，避免光照，期间每隔5分钟涡旋震荡15秒
5． 即刻放进微型台式离心机离心10分钟，速度为16000g
6． 小心抽去上清液（注意：确保没有水滴残留）（注意：可见紫色或粉红色沉淀）
7． 加入1毫升HEPENGBIO解离液（Reagent D）
8． 涡旋震荡15秒
9． 室温下孵育5分钟，避免光照（注意：确保充分溶解）
10． 转移到新的比色皿
11． 即刻放进分光光度仪检测（波长656nm）：获得样品吸光读数
12． 根据上述标准曲线获得样品对应糖胺多糖含量（微克）
 
五、 浓度计算
根据上述标准曲线样品对应糖胺多糖含量（微克）÷0.050（样品容量；毫升）=微克糖胺多糖/毫升