5’AMP活化蛋白激酶（5’AMP activated protein kinase；AMPK）属于丝氨酸/苏氨酸激酶（serine/threonine protein kinase）家属成员之一。其为从酵母到人体高度进化保留的激酶复合物，由3个亚体，α、β、γ构成：其中γ亚体有4个胱硫醚β合酶（cystathione beta synthase；CBS）结构域，又称为巴特曼（Bateman）结构域，以探测AMP和ATP的比例；α亚体含有催化结构域，一旦收到AMPKK或LKB1/MO25/STRAD 复合物催化的磷酸化后，AMPK被激活。所有亚体都有不同异构体形式，包括α1、α2、β1、β2、γ1、γ2和γ3。其功能在于保持细胞能量内环境恒定：促进脂肪酸β氧化、抑制胆固醇合成、促进肌肉葡萄糖吸收和调节胰岛素分泌等。AMPK在肝脏、脑和肌肉组织中高度表达。其磷酸化目标序列为 LKKLTRASFFGQ。基于底物LKKLTRASFFGQ，在ATP的存在下，受到5’AMP活化蛋白激酶的磷酸化，获得产物磷酸化多肽，进而通过丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；LDH）反应系统中，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的变化（340nm），来定量分析5’AMP活化蛋白激酶的活性。其反应方式为：
AMPK
LKKLTRASFFGQ  +  ATP  →  LKKLTRApSFFGQ  +  ADP
 
pyruvate kinase
Phosphoenolpyruvate  +  ADP       →      pyruvate  +  ATP
         
lactate dehydrogenase
pyruvate  +  NADH       →      lactate  +  NAD⁺
           （高吸收峰） （低吸收峰） 
 
产品内容
 
HEPENGBIO清理液（Reagent A）  120毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B）   10毫升
HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）    4毫升
HEPENGBIO酶促液（Reagent D）  500微升
HEPENGBIO反应液（Reagent E）  500微升
HEPENGBIO底物液（Reagent F）  500微升
HEPENGBIO阴性液（Reagent G）  500微升
 
保存方式
 
保存HEPENGBIO清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，严格避免光照和反复冻融；有效保证6月
 
用户自备
 
AMPK激酶：用于抑制剂筛选
1.5毫升离心管：用于样品保存的容器
15毫升锥形离心管：用于样品处理的容器
细胞刮脱棒：用于贴壁细胞脱离
（微型）台式离心机：用于细胞预处理
200微升1厘米光径比色皿或96孔板：用于光度分析操作的容器
分光光度仪或酶标仪：用于样品光度分析
 
实验步骤
 
一、 待测样品准备
 
1． 准备好75cm²细胞培养瓶或100mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 10⁷细胞）
2． 小心加入3毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A），覆盖生长表面
3． 小心抽去清理液
4． 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：避免使用胰酶消化）
5． 加入3毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A），混匀细胞
6． 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
7． 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
8． 小心抽去上清液
9． 加入100至500微升HEPENGBIO裂解液（Reagent B），充分混匀（注意：可以调节蛋白浓度）
10． 转移到预冷的1.5毫升离心管
11． 强力涡旋震荡15秒
12． 置于冰槽里孵育30分钟
13． 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
14． 小心移取100至500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
15． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用HEPENGBIO Bradford蛋白质浓度定量试剂盒）
16． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
 
二、 测定准备
 
1． 准备好待测样品（例如细胞裂解悬液等），置于冰槽里
2． 设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长为340nm，间隔1分钟，读数6次（共5分钟），并置零
3． HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度
 
三、 背景对照测定
 
1． 移取130微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入20微升HEPENGBIO酶促液（Reagent D）
3． 加入20微升HEPENGBIO反应液（Reagent E）
4． 加入20微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）
5． 放进30℃培养箱里静置3分钟
6． 加入10微升HEPENGBIO阴性液（Reagent G）
7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟
 
四、 样品测定
 
1． 移取130微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入20微升HEPENGBIO酶促液（Reagent D）
3． 加入20微升HEPENGBIO反应液（Reagent E）
4． 加入20微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）
5． 放进30℃培养箱里静置3分钟
6． 加入10微升待测样品（注意：100微克细胞裂解蛋白；样品须溶解）
7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟
 
五、 计算样品活性
 
[（样品读数－背景读数）X 0.2（体系容量；毫升）X样品稀释倍数]÷[0.010（样品容量；毫升）X 6.22（毫摩尔吸光系数）X 5（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克
 
单位＝微摩尔NADH/分钟
 
六、 酶标仪测定
 
1． 在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品
2． 分别移取130微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）到96孔板里
3． 分别加入20微升HEPENGBIO酶促液（Reagent D）
4． 分别加入20微升HEPENGBIO反应液（Reagent E）
5． 分别加入20微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）
6． 轻轻摇动96孔板
7． 在30℃温度下孵育3分钟
8． 分别加入10微升HEPENGBIO阴性液（Reagent G）或待测样品（100微克细胞裂解悬液蛋白）到相应孔里（注意：样品须清澈）
9． 轻轻摇动96孔板
10． 即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和5分钟读数
11． 活性计算：
 
[（样品读数－背景读数）X样品稀释倍数X 0.2（体系容量；毫升）]÷[0.010（样品容量；毫升）X 6.22（毫摩尔吸光系数）X 0.5（光径距离；厘米）X 5（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克
 
单位＝微摩尔NADH/分钟
 
七、抑制剂筛选
 
1． 在96孔板上做好相应标记：背景、完全活性和待测抑制剂样品
2． 按下表加入试剂，进行样品预处理
 

内容物	空背景对照	样本背景	完全酶活性	待测抑制剂酶活性
HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）	20微升	20微升	20微升	20微升
HEPENGBIO阴性液（Reagent G）	20微升	10微升	10微升	——
待测抑制剂	——	10微升	――	10微升
用户自备的纯化酶	——	——	10微升（1毫单位）	10微升（1毫单位）
96孔板每孔总量	空背景对照孔 （40微升）	样本背景孔 （40微升）	完全活性孔 （40微升）	待测抑制剂样品孔 （40微升）
轻轻摇动96孔板，混匀，放进30℃培养箱里孵育30分钟。然后进行下列操作

 
3． 分别移取100微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）到新的96孔板的所有孔里
4． 分别加入20微升HEPENGBIO酶促液（Reagent D）
5． 分别加入20微升HEPENGBIO反应液（Reagent E）
6． 分别加入20微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）
7． 轻轻摇动96孔板
8． 在30℃温度下孵育3分钟
9． 加入40微升上述预处理的待测样品
10． 即刻放进30℃酶标仪检测：测读0分钟和30分钟
11． 实际读数：0分钟读数—30分钟读数
12． 抑制活性计算：
1) [（完全活性读数－空背景对照读数）－（抑制剂样品活性读数－样本背景读数）]÷（完全活性读数－空背景对照读数）＝实际抑制百分率
2) IC50：50％抑制率所需的抑制剂浓度
X（所需抑制剂样品浓度）＝（已知抑制剂样品浓度÷实际抑制百分率）X 50％
i. 直接构建抑制曲线：纵座标（Y轴）为吸光单位（OD）；横座标（X轴）为已知抑制剂浓度