超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基

（hydroxyl radical；OH-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、单线态氧气（singlet oxygen）等细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡，甚而导致诸如冠心病、风湿性关节炎、肿瘤、退行性病变等各种病理状况。在生物系统内，通过抗氧化酶例如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶等，大分子，例如白蛋白、铜蓝蛋白（ceruloplasmin；CER）、铁蛋白（ferritin）和抗氧化因子，例如生育醇、类胡萝卜素、抗坏血酸、还原性谷胱甘肽和尿酸胆红素
（bilirubin）等，产生抗氧化能力，即捕获自由基的能力，达到消除或降低ROS的损害。通过稳定的有机氮自由基染料1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazylradical；DPPH），受到抗氧化剂的去自由基作用，呈现深紫色转化为黄色的变化，衡量体系中抗氧化剂捕获自由基、消耗抗氧化剂的能力，在分光光度仪（515nm波长）的帮助下，观察其峰值下降的变化，并与标准化抗氧化剂水溶性生育酚Trolox对照。
 

产品内容
HEPENGBIO 清理液（Reagent A）	500 毫升
HEPENGBIO 缓冲液（Reagent B）	20 毫升
HEPENGBIO 染色液 A（Reagent C1）	1 瓶
HEPENGBIO 染色液 B（Reagent C2）	10 毫升
HEPENGBIO 标准液（Reagent D）	200 微升
产品说明书	1 份
保存方式

 
保存 HEPENGBIO 清理液（Reagent A）在 4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里，有效保证 6 月

用户自备

 
50 毫升烧杯：用于样品操作的容器
15 毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
1.5 毫升离心管：用于标准样品配制的容器
4℃台式离心机：用于样品操作
200 微升 1 厘米光径比色皿或 96 孔板：用于比色的容器分光光度仪或酶标仪：用于比色分析
 

实验步骤

 

一、 样品准备

 
 
1、固态食品处理
1. 秤取 1 克固态食品或粉末到 50 毫升烧杯，杯口封口膜密封
2. 加入 8 毫升 HEPENGBIO 清理液（Reagent A）
3. 搅拌 30 分钟，充分混匀
4. 继续加入 HEPENGBIO 清理液（Reagent A）到终容量为 10 毫升
5. 过滤纸过滤，去除不溶性固体颗粒
6. 封口膜封口备用
 

2、液态食品处理

1. 移取 5 毫升待测液态食品到 15 毫升锥形离心管
2. 放进台式离心机离心 10 分钟，速度为 1500g
3. 移取上清液到新的 15 毫升锥形离心管
4. （选择步骤）可以加入适量的 HEPENGBIO 清理液（Reagent A）
5. （选择步骤）过滤纸过滤（如果离心处理，样品仍然不清澈）
6. 置于冰槽里备用或放进-20 冰箱里保存二、标准液准备
1. 准备好 5 个 1.5 毫升离心管，标记为 1 至 5 号管
2. 分别加入 50 微升 HEPENGBIO 缓冲液（Reagent B）到 2 至 5 号管
3. 移取 100 微升 HEPENGBIO 标准液（Reagent D）到 1 号管，混匀
4. 小心移取 50 微升 1 号管的 HEPENGBIO 标准液（Reagent D）到 2 号管，混匀
5. 小心移取 50 微升 2 号管稀释的 HEPENGBIO 标准液（Reagent D）到 3 号管，混匀
6. 小心移取 50 微升 3 号管稀释的 HEPENGBIO 标准液（Reagent D）到 4 号管，混匀
7. 将 1 至 5 号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表
 

管号	HEPENGBIO 缓冲液（Reagent B）	HEPENGBIO 标准液（Reagent D）	测定体系 标准 Trolox 浓度
1	0	100 微升	80 微摩尔/升
2	50 微升	50 微升	40 微摩尔/升
3	50 微升	50 微升	20 微摩尔/升

4	50 微升	50 微升	10 微摩尔/升
5	50 微升	0	0

 

三、 样品测读

 
 
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂置于室温下融化，移取 5 毫升 HEPENGBIO 染色液 B（Reagent C2） 到 1 瓶 HEPENGBIO 染色液 A（Reagent C1）里，混匀，置于暗室里，标记为 HEPENGBIO 染色工作液， 避免光照。然后进行下列操作。
 
1. 准备 1 个 96 孔板，做好标记：空白对照孔、标准样品孔、待测样品孔
2. 分别移取 205 微升 HEPENGBIO 缓冲液（Reagent B）到 96 孔板里的每个孔里
3. 分别加入 25 微升 HEPENGBIO 染色工作液
4. 加入 20 微升 HEPENGBIO 缓冲液（Reagent B）到空白对照孔
5. 加入 20 微升上述配制的 HEPENGBIO 标准液（Reagent D）到相应标准样品孔里
6. 加入 20 微升样品（100 微克食品总量）到待测样品孔里
7. 轻轻摇动 96 孔板，使其混匀
8. 室温下孵育 15 分钟
9. 即刻放进酶标仪里测读：515nm 波长
10. 分析结果：
1） 构建标准曲线：纵座标（Y 轴）为吸光单位（OD₅₁₅nm）；横座标（X 轴）为标准Trolox 浓度（微摩尔/升）
2） 空白对照孔为最大吸光单位（OD₅₁₅nm）读数
3） 标准样品孔和待测样品孔为实际吸光单位（OD₅₁₅nm）读数
4） 根据标准曲线获得样品对应 Trolox 浓度（微摩尔/升）
5） 计算样品实际总抗氧化能力
 
【根据标准曲线获得样品对应Trolox 浓度（微摩尔/升）X 0.25（体系容量；毫升） X 样品稀释倍数】÷0.02
（样品容量；毫升）＝（微摩尔/升 TROLOX 等值）
 
6） 根据下列公式计算测定体系中样品量的总抗氧化能力（实际抑制百分率）
 
【（空白对照孔吸光单位读数－实际吸光单位读数）÷空白对照孔吸光单位读数】X 100％
 
7） IC50：50％抑制率所需的样品单位：TROLOX 等值或样品重量（毫克/毫升）或样品容量（微升）
 
X（所需样品单位）＝（已知样品单位÷实际抑制百分率）X 50％