腺苷三磷酸酶，又称为ATP酶（adenosine triphosphatase；ATPase或ATP phosphohydrolase；EC3.6.1.3），属于磷酸水解酶，可以催化含磷的酸酐分解，即催化三磷酸腺苷分解为二磷酸腺苷和无机磷。ATP酶的去磷酸化反应释放出能量，成为细胞生命代谢的能源。ATP酶为跨膜蛋白（transmembrane），帮助传输各种代谢分子进出细胞。根据ATP酶的结构和功能，分为五类不同的ATP酶，即F、V、A、P和E型。P型，又称为E1E2 型，存在于细菌和真核细胞膜和细胞器上，其功能在于水解ATP获得能量，跨膜运输各种化学分子，包括Ca²⁺传输性、Na⁺-K⁺ /H⁺-K⁺传输性、H⁺传输性和所有细菌型等，其中胃氢/钾ATP酶，一种与胃酸分泌相关的质子泵，属于这一类型。V型，又称为V1V0型，主要存在于真核细胞的液泡（vacuole）中。A型，又称为A1A0型，存在于古生菌（archaea）中。E型，为细胞表面的酶。V型，又称为V1V0型，也称为氢V型ATP酶，主要存在于所有真核细胞的囊泡（vacuole或vesicle）中。F型ATP酶（F type ATPase），又称为ATP合成酶（ATP synthase）、F1F0 ATP酶（F1F0 ATPase）和线粒体呼吸链复合物V（complex V），主要在线粒体、叶绿体或细菌细胞膜上，进行氧化磷酸化或光合作用。细菌质膜型F型ATP酶主要有两个结构域：F0为质子转运通道，由3个膜蛋白构成，包括a、b、c等；和F1催化活性结构域，由水溶性的α3β3γδε蛋白构成。其最特征性的酶活性是寡霉素敏感的ATP合成酶。细菌F型ATP酶的主要功能通过ATP合成的逆向反应，水解ATP，产生膜内外质子梯度变化，帮助细菌离子转运和鞭毛运动（flagella motility）。基于ATP，在寡霉素参与下，受到F型ATP酶的水解，进而通过丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；LDH）反应系统中，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），产生的吸光峰值的变化（340nm），来定量分析F型 ATP酶活性。其反应系统为：
 
 
产品内容
 
HEPENGBIO裂解液（Reagent A）    毫升
HEPENGBIO保存液（Reagent B）  毫升
HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）  毫升
HEPENGBIO反应液（Reagent D）       毫升
HEPENGBIO阴性液（Reagent E）    毫升
HEPENGBIO底物液（Reagent F）  微升
HEPENGBIO专性液（Reagent G）    微升
产品说明书     1份
 
保存方式
 
保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融；HEPENGBIO反应液（Reagent D），避免光照，有效保证6月
 
用户自备
 
15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
1.5毫升离心管：用于样品操作和保存的容器
（微型）台式离心机：用于样品操作
恒温摇床：用于细菌培养
培养箱：用于反应孵育
比色皿：用于光度分析的容器
分光光度仪：用于光度分析
 
实验步骤
 
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化；HEPENGBIO反应液（Reagent D）注意避光。然后进行下列操作。
 
一、 样品准备
 
1． 准备好10毫升待测的细菌放进37℃摇床孵育16小时，速度为220RPM
2． 直至OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 10⁷细胞/毫升
3． 置于冰槽里5分钟
4． 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为1000g
5． 小心抽去上清液
6． 加入xx微升HEPENGBIO裂解液（Reagent A），充分混匀
7． 转移到预冷的1.5毫升离心管
8． 强力涡旋震荡15秒
9． 置于冰槽里30分钟，期间强力涡旋震荡15秒三次
10． 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为300g（或1000RPM，例如eppendorf 5415）
11． 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
12． 放进4℃微型台式离心机离心15分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
13． 小心去掉上清液 
14． 加入xx微升HEPENGBIO保存液（Reagent B），混匀
15． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用HEPENGBIO Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－ ）
16． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
 
二、测定准备
 
1． 准备好上述待测样品，置于冰槽里 
2． 设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长为340nm，间隔1分钟，读数6次（共5分钟），并置零
3． HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度
 
三、 背景对照测定
 
1． 移取xx微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升HEPENGBIO反应液（Reagent D）
3． 加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）
4． 放进30℃培养箱里静置3分钟
5． 加入xx微升HEPENGBIO阴性液（Reagent E）
6． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
7． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟 －340波长读数1分钟或5分钟
 
四、 样品总活性测定
 
1． 移取xx微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升HEPENGBIO反应液（Reagent D）
3． 加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）
4． 放进30℃培养箱里静置3分钟
5． 加入100微升待测样品（注意：20微克膜蛋白或50微克细菌总蛋白；样品须溶解；参见注意事项10）
6． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
7． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数1分钟或5分钟
 
五、 样品非特异活性测定
 
实验开始前，移取100微升待测样品（注意：20微克膜蛋白或50微克细菌总蛋白；样品须溶解；参见注意事项10）到1.5毫升离心管，加入xx微升HEPENGBIO专性液（Reagent G），混匀后，放进30℃培养箱里孵育15分钟。然后置于冰槽里备用

1． 移取xx微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升HEPENGBIO反应液（Reagent D）
3． 加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）
4． 放进30℃培养箱里孵育3分钟
5． 加入120微升上述预处理的待测样品
6． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
7． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品非特异活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数1分钟或5分钟
 
六、 计算样品活性
 
1）样品活性（总活性和非特异活性）
 
 
 
2）样品特异活性
 
七、 酶标仪测定
 
1） 样品总活性测定
 
1． 在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品总活性
2． 分别移取xx微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）到96孔板里
3． 分别加入xx微升HEPENGBIO反应液（Reagent D）
4． 分别加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）
5． 轻轻摇动96孔板
6． 在30℃温度下孵育3分钟
7． 分别加入xx微升HEPENGBIO阴性液（Reagent E）或待测样品（注意：20微克膜蛋白或50微克细菌总蛋白）到相应孔里（注意：样品须清澈）
8． 轻轻摇动96孔板
9． 即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和5分钟读数
10． 背景对照和样品总活性实际读数：340波长读数0分钟 －340波长读数1分钟或5分钟
11． 活性计算
 
 
2） 样品非特异活性测定
 
实验开始前，移取25微升待测样品（注意：20微克膜蛋白或50微克细菌总蛋白；样品须溶解）到1.5毫升离心管，加入xx微升HEPENGBIO专性液（Reagent G），混匀后，放进30℃培养箱里孵育15分钟。然后置于冰槽里备用
 
1． 在96孔板上做好相应标记：待测样品
2． 移取xx微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）到96孔板里
3． 加入xx微升HEPENGBIO反应液（Reagent D）
4． 加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）
5． 轻轻摇动96孔板
6． 在30℃温度下孵育3分钟
7． 加入30微升上述预处理的待测样品
8． 轻轻摇动96孔板
9． 即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和5分钟读数
10． 样品非特异活性实际读数：340波长读数0分钟 －340波长读数1分钟或5分钟
11． 活性计算
3） 样品特异活性计算