蛋白激酶A（protein kinase A；PKA），又称cAMP依赖性蛋白激酶（cAMP dependent protein kinase），是第二信使依赖性酶。通过影响腺苷酸环化酶（adenylate cyclase；AC）和磷酸二酯酶（phosphodiesterase）的活性，而决定cAMP水平，达到调节PKA活性，进而调节细胞对于各种外部刺激的反应，包括细胞生长、代谢、DNA复制、细胞分裂、肌动蛋白细胞骨架重排等。该全酶（holoenzyme）具有两个催化亚体和两个调节亚体构成的四联体结构。cAMP结合调节亚体，而释放出活化的催化亚体，产生目标蛋白上丝/苏氨酸
（serine/threonine）的磷酸化，诸如CREB、Histone H1、CREM、NF-κB和核受体等，而调控一系列细胞活动。其磷酸化目标序列为Arg-Arg-X-Ser/Thr或Lys-Arg-X-X- Ser/Thr。蛋白激酶A 至少有两个亚酶：I型亚酶存在于胞浆内，而二型亚酶与细胞膜、细胞器和细胞骨架相关。基于底物XXXXXX，在ATP的存在下， 受到PKA激酶的磷酸化，获得产物磷酸化多肽，进而通过丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脱氢酶
（lactate dehydrogenase；LDH）反应系统中，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其峰值的变化（340nm），来定量分析蛋白激酶A的活性。其反应方式为：
 

产品内容

 
HEPENGBIO 清理液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO 裂解液（Reagent B） 毫升
HEPENGBIO 缓冲液（Reagent C） 毫升
HEPENGBIO 酶促液（Reagent D） 微升
HEPENGBIO 反应液（Reagent E） 微升
HEPENGBIO 底物液（Reagent F） 微升
HEPENGBIO 阴性液（Reagent G） 微升
产品说明书 1 份
 

保存方式

 
保存 HEPENGBIO 清理液（Reagent A）在 4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，严格避免光照和反复冻融；有效保证 6 个月。

用户自备

 
PKA 激酶：用于抑制剂筛选
1.5 毫升离心管：用于样品保存的容器
15 毫升锥形离心管：用于样品处理的容器细胞刮脱棒：用于贴壁细胞脱离
（微型）台式离心机：用于细胞预处理
比色皿或酶标板：用于比色分析操作的容器分光光度仪或酶标仪：用于样品比色分析
 

实验步骤

 

一、 待测样品准备

 
 
1. 准备好 25cm²细胞培养瓶或 60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1 至 5 X 10⁶细胞）
2. 小心加入 毫升 HEPENGBIO 清理液（Reagent A），覆盖生长表面
3. 小心抽去清理液
4. 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：避免使用胰酶消化）
5. 加入 毫升 HEPENGBIO 清理液（Reagent A），混匀细胞
6. 移入到预冷的 15 毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
7. 放进 4℃台式离心机离心 5 分钟，速度为 300g
8. 小心抽去上清液
9. 加入 微升 HEPENGBIO 裂解液（Reagent B），充分混匀 10．转移到预冷的 1.5 毫升离心管
11. 强力涡旋震荡 15 秒
12. 置于冰槽里孵育 30 分钟
13. 放进 4℃微型台式离心机离心 5 分钟，速度为 16000g（或 13000RPM，例如 eppendorf 5415）
14. 小心移取 500 微升上清液到新的预冷的 1.5 毫升离心管
15. 移取 10 微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 HEPENGBIO Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒－
HEPENGBIO30030.1）
16. 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作二、 测定准备
1. 准备好待测样品（例如组织裂解悬液等），置于冰槽里
2. 设定好分光光度仪（温度为 30℃）：波长为 340nm，间隔 5 分钟，读数 7 次（共 30 分钟），并置零三、 背景对照测定
1. 移取 微升 HEPENGBIO 缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2. 加入 微升 HEPENGBIO 酶促液（Reagent D）
3. 加入 微升 HEPENGBIO 阴性液（Reagent G）
4. 放进 30℃培养箱里静置 2 分钟
5. （选择步骤）放进分光光度仪，置零

6. （选择步骤）取出比色皿
7. 加入 微升 HEPENGBIO 反应液（Reagent E）
8. 加入 微升 HEPENGBIO 底物液（Reagent F）
9. 上下倾倒数次，混匀（限定在                  3                                   秒之内） 10．即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340 波长读数 0 分钟 －340 波长读数 30 分钟
 

四、 样品测定

 
 
1. 移取 微升 HEPENGBIO 缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2. 加入 微升 HEPENGBIO 酶促液（Reagent D）
3. 加入 5 微升待测样品（注意：50 微克组织蛋白；样品须溶解）
4. 放进 30℃培养箱里静置 2 分钟
5. （选择步骤）放进分光光度仪，置零
6. （选择步骤）取出比色皿
7. 加入 微升 HEPENGBIO 反应液（Reagent E）
8. 加入 微升 HEPENGBIO 底物液（Reagent F）
9. 上下倾倒数次，混匀（限定在                 3                                 秒之内） 10．即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数：340 波长读数 0 分钟 －340 波长读数 30 分钟
 

五、 计算样品活性六、酶标板测定

1. 在 96 孔酶标板上做好相应标记：背景对照和样品
2. 分别移取 微升 HEPENGBIO 缓冲液（Reagent C）到 96 孔板中
3. 分别加入 微升 HEPENGBIO 酶促液（Reagent D）
4. 分别加入 微升 HEPENGBIO 阴性液（Reagent G）或待测样品（50 微克组织蛋白）到相应孔中（注意：样品须清澈）
5. 轻轻摇动 96 孔酶标板
6. 在 30℃温度下孵育 2 分钟
7. 分别加入 微升 HEPENGBIO 反应液（Reagent E）
8. 分别加入 微升 HEPENGBIO 底物液（Reagent F）
9. 轻轻摇动酶标板
10. 即刻放进酶标仪检测：0 分钟读数和 30 分钟读数
11. 活性计算： 七、抑制剂筛选
1. 在 96 孔酶标板上做好相应标记：背景、零抑制、完全抑制和待测抑制剂样品
2. 按下表加入试剂

内容物	样本背景	零抑制对照 （0％抑制）	完全抑制对照 （100％抑制）	待测抑制活性
HEPENGBIO 缓冲液 （Reagent C）	微升	微升	微升	微升