超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基
（hydroxyl radical；OH-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、单线态氧气（singlet oxygen）等 细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡，甚而导致植物气孔关闭（stomatal closure）和根毛发育（root hair）异常等病理状况。鲁米诺（luminol），又称氨基邻苯二甲酰肼（luminol；3-aminophthalic hydrazide 5-amino-2,3-dihvdro- 1,4-phthalazinedione），是一种脂溶性的发光剂，氧化后生成鲁米诺自由基而化学发光，具有460nm左右峰值的带状光谱，肉眼可观察到鲜明的紫蓝色。鲁米诺以单价氧化形式与超氧自由基阴离子反应，产生不稳定性内过氧化物或二氧环丁烷（Dioxetane），由此分解成电激发状态，通过释放光子，回复到基态。鲁米诺作为探针，可以检测植物中过氧化氢、超氧自由基阴离子和羟自由基，其中过氧化氢最强，其发光强度与过氧化氢水平成正相关。
 

产品内容

 
HEPENGBIO 清理液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO 强化液（Reagent B） 毫升
HEPENGBIO 发光液（Reagent C） 毫升
产品说明书 1 份
 

保存方式

 
保存 HEPENGBIO 强化液（Reagent B）和HEPENGBIO 发光液（Reagent C）在－20℃冰箱里，严格避免光照；其余的保存在 4℃冰箱里；有效保证 6 月
 

用户自备

15 毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
1.5 毫升离心管：用于样品操作的容器微型台式离心机：用于去除样品杂质
DOUNCE 匀浆器：用于裂解植物组织样品超声仪：用于裂解植物组织样品
测试管或黑色 96 孔板：用于发光检测用的容器化学发光仪：用于检测化学发光
 

实验步骤

 
一、 样品预处理
 
 
1. 准备好新鲜的植物组织（叶片、谷粒、种子等），并秤重以确定 500 毫克组织重量
2. （选择步骤）放进预冷的 15 毫升锥形离心管
3. （选择步骤）加入 xx 毫升 HEPENGBIO 清理液（Reagent A）清洗 1 次
4. 即刻用刀片切碎组织
5. 放进一个预冷的 15 毫升锥形离心管
6. 加入预冷的 xx 毫升 HEPENGBIO 清理液（Reagent A）
7. 涡旋震荡 5 秒，充分混匀
8. 即刻放进预冷的 DOUNCE 匀浆器，在冰槽里用研磨棒匀化组织（约 80 下）
9. 将所有组织匀浆物移入 1.5 毫升离心管
10. 强力涡旋震荡 5 秒，充分混匀
11．（选择步骤）在冰槽里，置于 200 瓦超声仪下，功率 50％，猝击 5 秒
12. 放进 4℃微型台式离心机离心 10 分钟，速度为 5000g（或 7500RPM，例如 eppendorf 5415）
13. 小心移出上清液（注意：不要触碰沉淀物）到另一个新的预冷的 1.5 毫升离心管
14．（选择步骤）如果上清液含有肉眼可见的残渣，重复离心 5 分钟一次，速度为 5000g（或 7500RPM， 例如 eppendorf 5415）
15．（选择步骤）移取 5 微升进行蛋白定量测定，并调整蛋白浓度为 20 毫克/毫升（注意：建议使用
HEPENGBIO Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒－HEPENGBIO30030.1）
16．置于冰槽里继续后续操作（1 小时内） 二、 测读
测读开始前，打开化学发光仪，设定仪器内温度为 37℃预热和整合测读 10 秒或 15 分钟；然后关掉实验室的灯光。将－20℃冰箱里的试剂置入冰槽里融化，严格置于暗室里。然后进行下列操作。
 
1. 准备好测试管，做好标记：阴性对照、样品本底和样品活性
2. 移取 xx 微升 HEPENGBIO 清理液（Reagent A）到阴性对照测试管
3. 移取 400 微升上述预处理的待测样品到样品本底测试管
4. 移取 400 微升上述预处理的待测样品到样品活性测试管
5. 分别加入 xx 微升 HEPENGBIO 强化液（Reagent B）到上述测试管，除样品本底测试管外
6. 分别加入 xx 微升 HEPENGBIO 发光液（Reagent C）到上述测试管，除样品本底测试管外
7. 轻轻涡旋混匀
8. 即刻放进 37℃化学发光仪里测读