腺嘌呤核苷酸（adenine nucleotides），简称腺苷，包括单磷酸腺苷、二磷酸腺苷和三磷酸腺苷，是一种单体单位，为核糖核酸（RNA）和脱氧核糖核酸（DNA）的组成成分，并提供化学能量，在能量代谢通路中维护诸如肌肉、胞膜等组织细胞结构的生化和生理功能，调节细胞糖酵解、三羧酸循环、电子传递系统、氧化磷酸化活动。腺嘌呤核苷酸在细胞中浓度低，且不稳定，通常通过其类型不同、浓度差异、分布状况，来评价细胞的代谢情况和能量状态。单磷酸腺苷（Adenosine monophosphate；AMP），又称为5'-腺嘌呤核苷酸或腺苷酸（5'-adenylic acid），是一种在（脱氧）核糖核酸中发现的核苷酸。它是一种磷酸及核苷腺苷的酯，并由磷酸基团、戊糖核酸糖及碱基腺嘌呤所组成。分子式为C10H14N5O7P，分子量347。AMP可以通过腺苷酸激酶（adenylate kinase）催化2分子ADP生成，或通过ATP以及ADP水解产生。AMP常以腺苷-3',5'-环化一磷酸（cAMP）形式存在于细胞中。AMP与ATP之比反映细胞ATP生成状况以及脂肪酸氧化程度。二磷酸腺苷（adenosine diphosphate；ADP），参与ADP-ATP循环，提供热能转换和动态平衡，尤其在线粒体需氧呼吸、光合成等实现。三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate；ATP）存在于所有代谢活跃的细胞内，是细胞活力的标志。一旦细胞凋亡或坏死，ATP浓度急遽下降。通过高氯酸酸性处理，排除蛋白质干扰，碱性中和后，在高效液相色谱仪和紫外光度仪下（254nm波长）检测分析，分离出ATP、ADP、AMP波峰，以定量其含量。 
 
产品内容
 
HPBIO清理液（Reagent A）       60毫升
HPBIO裂解液（Reagent B）  10毫升
HPBIO酸性液（Reagent C）        1毫升
HPBIO中和液（Reagent D）     2毫升
HPBIO流相液A（Reagent E）      500毫升
HPBIO流相液B（Reagent F）      500毫升
HPBIO 标准液（Reagent G） 500微升
产品说明书      1份
 
 
 
 
保存方式
 
保存HPBIO标准液（Reagent G）在-20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；HPBIO酸性液（Reagent C）和HPBIO中和液（Reagent D）具有腐蚀性，注意操作安全；有效保证6月
 
用户自备
 
HANK平衡盐缓冲溶液（HPBIO12028）或PBS缓冲溶液（HPBIO12033）：用于清理细胞
胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（HPBIO12024）：用于细胞脱离
完全细胞培养液（HPBIO12052）：用于细胞处理所需的培养基
15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
50毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
1.5毫升离心管：用于样品操作的容器
4℃（微型）台式离心机：用于样品操作
DOUNCE匀浆器：用于裂解细胞
高效液相色谱仪（HPLC）：用于定量测定
 
实验步骤
 
一、 样品准备 
 
1． 准备1瓶75cm²细胞培养瓶的细胞（1 X 10⁷），直至细胞生长铺满整个培养表面
2． 加入10毫升用户自备的HANK平衡盐缓冲溶液或PBS缓冲溶液到每个细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面，然后抽去
3． 加入3毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个细胞生长表面
4． 置入37℃培养箱3分种
5． 轻轻手击震动培养瓶，使细胞脱落，
6． 分别加入10毫升用户自备的完全细胞培养液
7． 移入一个50毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从此步骤开始）
8． 放进台式离心机离心10分钟，速度为200g
9． 小心抽去上清液
10． 加入3毫升预冷的HPBIO清理液（Reagent A），混匀细胞
11． 放进台式离心机离心10分钟，速度为300g
12． 小心抽去上清液
13． 加入500微升预冷的HPBIO裂解液（Reagent B）
14． 涡旋震荡5秒，充分混匀细胞颗粒群
15． 即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器
16． 在冰槽里用匀浆棒匀化细胞（约40下）
17． 将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管
18． 放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
19． 小心移取360微升上清液到1.5毫升离心管
1． 加入40微升预冷的HPBIO酸性液（Reagent C）
2． 涡旋震荡1分钟
3． 转移到1.5毫升离心管
4． 放进4℃微型台式离心机再次离心10分钟，速度为6000g
5． 小心移取上清液到新的1.5毫升离心管
6． 加入62微升HPBIO中和液（Reagent D），充分混匀
7． 置于冰槽里静置30分钟
8． 即刻移入上清液到新的1.5毫升离心管（注意：避免移取沉淀颗粒）
20． 放进－70℃冰箱里保存或置于冰槽里待测
 
二、测定准备
 
1． 开启仪器预热15分钟
2． 根据下表设置高效液相色谱仪（HPLC）参数
 
 

参数	推荐	补充说明
色谱柱	长度：25cm 直径：4.6mm	Waters仪器或 Agilent仪器
固定相	ODS
流动相	HPBIO流相液A（Reagent E）和HPBIO流相液B（Reagent F）	参见运行程序
流速	1.3毫升/分钟
注射容量	50微升	10微升至100微升
检测	紫外
波长	254nm
柱温	25℃
出峰时间（retention）	5.6分钟（ATP）；6.5分钟（ADP）；10分钟(AMP)	参考
运行时间	15分钟	参考

 
3． 运行程序
 

运行时段	程序	时间
开机后预运行	100% HPBIO流相液A（Reagent E）	总10分钟
检测运行时段	100% HPBIO流相液A（Reagent E） 0%HPBIO流相液B（Reagent F）	0至9分钟
	100% HPBIO流相液A（Reagent E）至 75% HPBIO流相液A（Reagent E） 0%HPBIO流相液B（Reagent F）至25%HPBIO流相液B（Reagent F）	9至15分钟
关机前运行	100% HPBIO流相液A（Reagent E） 0%HPBIO流相液B（Reagent F）	总10分钟

 
三、 标准样品配制
 
1． 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管
2． 分别加入100微升HPBIO流相液A（Reagent E）到1至5号管
3． 移取100微升HPBIO标准液（Reagent G）到1号管，混匀
4． 小心移取100微升1号管稀释的HPBIO标准液（Reagent G）到2号管，混匀
5． 小心移取100微升2号管稀释的HPBIO标准液（Reagent G）到3号管，混匀
6． 小心移取100微升3号管稀释的HPBIO标准液（Reagent G）到4号管，混匀
7． 将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表
 

管号	HPBIO流相液A（Reagent E）	HPBIO标准液（Reagent G）	标准ATP/ADP/AMP浓度
1	100微升	100微升	100微摩尔/升
2	100微升	100微升1号管	50微摩尔/升
3	100微升	100微升2号管	25微摩尔/升
4	100微升	100微升3号管	12.5微摩尔/升
5	100微升	0	0

 
四、色谱分析
 
1． 将上述配制的HPBIO标准液（Reagent G）和待测样品放进冰槽里等待
2． 每次（每个样品）注射50微升
3． 按照检测运行程序每次（每个样品）运行15分钟
4． 获得色谱波峰图：波峰面积（peak area）或峰值，保存记录
 
五、计算样本ATP/ADP/AMP浓度
 
1． 方法一：通过仪器中的软件进行测算
2． 方法二：构建标准曲线：纵座标（Y轴）为波峰面积（peak area）；横座标（X轴）为标准ATP/ADP/AMP浓度（微摩尔/升），根据标准曲线获得样品对应ATP/ADP/AMP浓度（微摩尔/升）
3． 方法三：公式计算（选择单一浓度的标准液）
 
样本ATP/ADP/AMP浓度（微摩尔/升）=【样本波峰面积（peak area）X标准ATP/ADP/AMP浓度】÷对应标准ATP/ADP/AMP浓度的波峰面积