外膜囊泡（outer membrane vesicle；OMV）为含有周质内容物（包括外膜蛋白、DNA、RNA、脂多糖、脂质、周质蛋白、黏附素、免疫调节化合物等）的球形电子致密芽状体（spherical bud），细胞外间隔体，双层磷脂，20 至 200 纳米大小，来自于革兰氏阴性细菌周边突起物的释放形成或胞外分泌产物，使之与环境或宿主细胞进行反应，并调解各种功能，包括促进病理形成，调节细菌互动，转运各种信号分子（例如 DNA、RNA、蛋白质、内毒素、毒力因子等），保护细菌生存、结合和侵入，引起毒性，产生抗生素抗性等。外膜囊泡的产量取决于细菌生长周期、营养条件、温度、氧化应激状态等。病原菌的外膜囊泡 10 倍于非病原菌体。外膜囊泡具有疫苗开发中免疫调节潜力。通过差速离心和蛋白酶抑制混合剂，获得高纯外膜囊泡，充分保留其蛋白质的免疫和生物学活性。

产品内容

HEPENGBIO 保存液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO 溶解液（Reagent B） 毫升
HEPENGBIO 活性液（Reagent C） 微升
产品说明书 1 份

保存方式

保存 HEPENGBIO 活性液（Reagent C）在-20℃冰箱里，其余的保存在 4℃冰箱里，有效保证 6 月

用户自备

50 毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
1.5 毫升离心管：用于样品保存的容器分光光度仪：用于测定细菌浓度
台式离心机：用于样品操作 超速离心机：用于样品操作 恒温摇床：用于培养细菌细胞
0.45 微米滤膜：用于样品操作真空浓缩装置：用于样品操作

实验步骤

实验开始前，将试剂盒里的 HEPENGBIO 活性液（Reagent C）从－20℃的冰箱里取出，置入冰槽里冻融， 然后移出xx 毫升 HEPENGBIO 溶解液（Reagent B）到 1.5 毫升离心管，加入 xx 微升 HEPENGBIO 活性液（Reagent C），充分混匀，置于冰槽里，标记为 HEPENGBIO 溶解工作液。然后进行下列操作。

1.准备好 1 毫升过夜培养的新鲜细菌样品
2.移取 500 微升到 50 毫升细菌培养液（注意：用户可以进行诱导培养，例如无铁培养等）
3.放进 37℃恒温摇床孵育过夜，速度为 200RPM
4.在分光光度仪上测 OD600 为 1（1 OD＝1 X 109 细胞/毫升；总量为 5 X 1010 细胞）
5.转移到预冷的 50 毫升锥形离心管
6.放进 4℃台式离心机离心 30 分钟，速度为 5000g
7.小心移取上清液到新的 50 毫升锥形离心管
8.重复实验步骤 6 和 7 一次
9.使用 0.45 微米滤膜真空过滤一次
10．（选择步骤）使用 100kD 蛋白临界点浓缩处理
11.放进 4℃超速离心机离心 3 小时，速度为 150000g
12.小心抽去上清液
13.加入 xx 微升预冷的 HEPENGBIO 保存液（Reagent A）
14.或加入 xx 微升预冷的含有 HEPENGBIO 溶解液（Reagent B）和 HEPENGBIO 活性液（Reagent C） 的 HEPENGBIO 溶解工作液
15.用枪头上下抽吸，充分混匀
16.转移到到新的预冷的 1.5 毫升离心管
17.即刻放进－70℃冰箱里保存或置于冰冰槽里备用
18.进行后续蛋白定量、荧光定量或电镜检测等

注意事项

1.本产品为 20 次（50 毫升菌液）操作
2.所有操作须在 4℃状态下进行
3.建议使用新鲜细菌接种，培养到指数生长阶段为理想状态
4.HEPENGBIO 活性液（Reagent C）避免反复冻融
5.本产品按照 50 毫升培养菌液配制。如果操作不同菌液容量，可相应调整试剂用量
6.根据菌种不同，50 毫升（OD600＝1）菌液可获得 5 至 100 微克外膜囊泡蛋白
7.制备产物如果放在－70℃冰箱里储存备用，严格避免反复冻融