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磷酸二酯酶（phosphodiesterase；PDE；EC2.7.1.11），又称为环核苷酸磷酸二酯酶（cyclic nucleotide phosphodiesterase），包括腺苷-3',5'-环化一磷酸（cyclic adenine monophosphate；cAMP）或鸟苷-3',5'-环化一磷酸（cyclic guanine monophosphate；cGMP）。通过水解环核苷酸（cAMP或cGMP）的磷酸二酯键（phosphodiester bond）产生5’-核苷（5’-nucleotides），使环核苷酸失活，达到调控第二信使分子环核苷酸的水平。其中环腺苷酸（cAMP）是存在于所有生命体细胞内重要的第二信使，以调节细胞形态、生长、分化、炎症、蛋白磷酸化、基因转录等各种功能。基于氨基酸序列、底物特异性、调节特征、组织分布和药理特性等，磷酸二酯酶家属分为11种亚酶，例如PDE4/7/8是cAMP为底物；PDE5/6/9是cGMP为底物；PDE1/2/3/10是cAMP/cGMP为底物等，具有不同的生化特性、组织表达特异性和通路特征。 磷酸二酯酶5是主要的cGMP代谢性酶，存在于体内平滑肌组织细胞里。参与cGMP的信号传导和Corpus cavernosum以及血管平滑肌作用。PDE5抑制剂常用于治疗勃起障碍和肺动脉性高血压等。基于底物环核苷酸，在磷酸二酯酶5敏感性抑制剂 （MY-5445 [1-(3-Chlorophenylamino)-4-phenylphthalazine]）存在的情况下，通过磷酸二酯酶5的催化作用，产生1-磷酸鸟苷产物后，经由5-核苷酸酶（5-nucleotidase；5-NT）作用，释放出游离磷酸根，进而与孔雀绿染料发生显色反应后，通过分光光度仪（660nm波长），来定量分析磷酸二酯酶5的特异活性。磷酸二酯酶5酶连续循环反应系统为：
产品内容
HEPENGBIO清理液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B） 毫升
HEPENGBIO缓冲液（Reagent C） 毫升
HEPENGBIO酶促液（Reagent D） 微升
HEPENGBIO底物液（Reagent E） 微升
HEPENGBIO阴性液（Reagent F） 微升
HEPENGBIO终止液（Reagent G） 毫升
HEPENGBIO显色液（Reagent H） 毫升
HEPENGBIO标准液（Reagent I） 微升
HEPENGBIO专性液（Reagent J） 微升
产品说明书 1份
保存方式
保存HEPENGBIO裂解液（Reagent B）、HEPENGBIO酶促液（Reagent D）、HEPENGBIO底物液（Reagent E）、HEPENGBIO显色液（Reagent H）、HEPENGBIO标准液（Reagent I）和HEPENGBIO专性液（Reagent J）在－20℃冰箱里，避免反复冻融；其余的保存在4℃冰箱里；HEPENGBIO终止液（Reagent G）和HEPENGBIO显色液（Reagent H）具有腐蚀性，避免直接用手接触；HEPENGBIO显色液（Reagent H）避免光照，有效6月
用户自备
1.5毫升离心管：用于样品保存的容器
15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器
（微型）台式离心机：用于样品操作
比色皿或酶标板：用于比色分析的容器
分光光度仪或酶标仪：用于比色分析
实验步骤
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后进行下列操作。
一、 样品准备
1． 手术取出动物组织，并秤重以确定500毫克组织重量
2． （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管
3． （选择步骤）加入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A）清洗1次
4． 移入到一个液氮冻存管
5． 即刻放进液氮罐过夜
6． 次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）
7． 放进一个15毫升锥形离心管
8． 加入置于冰槽里的xx微升HEPENGBIO裂解液（Reagent B）
9． 强力涡旋震荡30秒，充分混匀
10． 放进冰槽里孵育30分钟，期间每10分钟强力涡旋震荡30秒（注意：如需暂时停止，放进－70℃冰箱里储存备用）
11． 即刻放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为10000g
12． 小心移取上清液到新的无菌的1.5毫升离心管
13． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用HEPENGBIO Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－HEPENGBIO30030.1）
14． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、 测定准备
1． 开启并设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长660nm，并置零
2． 从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；HEPENGBIO显色液（Reagent H）避免光照
3． HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度
三、 标准曲线测定
1． 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管
2． 按下表分别加入HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）和HEPENGBIO标准液（Reagent I）到每个离心管，混匀
3． 将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表
4． 加入40微升上述配制的标准液到新的比色皿
5． 加入xx微升HEPENGBIO酶促液（Reagent D）
6． 在30℃温度下孵育30分钟
7． 移取xx微升HEPENGBIO阴性液（Reagent F）
8． 加入xx微升HEPENGBIO终止液（Reagent G），混匀
9． 加入xx微升HEPENGBIO显色液（Reagent H），混匀
10． 室温下静置15分钟，避免光照
11． 即刻放进分光光度仪检测：获得吸光读数
12． 重复实验步骤4至11四次
13． 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为吸光单位（A）；横座标（X轴）为标准5-GMP浓度（微摩尔/升）
四、 样品背景测定
1． 移取xx微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入5微升待测样品（50微克蛋白）（注意：样品须清澈）
3． 上下倾倒数次，混匀
4． 在30℃温度下孵育30分钟
5． 移取xx微升HEPENGBIO阴性液（Reagent F）
6． 加入xx微升HEPENGBIO终止液（Reagent G），混匀
7． 加入xx微升HEPENGBIO显色液（Reagent H），混匀
8． 室温下静置15分钟，避免光照
9． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品背景读数
10． 根据标准曲线获得样品背景对应5-GMP浓度（微摩尔/升）
五、 样品总活性测定
1． 移取xx微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升HEPENGBIO酶促液（Reagent D）
3． 加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent E）
4． 上下倾倒数次，混匀
5． 在30℃温度下孵育3分钟
6． 加入5微升待测样品（50微克蛋白）（注意：样品须清澈）
7． 上下倾倒数次，混匀
8． 在30℃温度下孵育30分钟
9． 移取xx微升HEPENGBIO阴性液（Reagent F）
10． 加入xx微升HEPENGBIO终止液（Reagent G），混匀
11． 加入xx微升HEPENGBIO显色液（Reagent H），混匀
12． 室温下静置15分钟，避免光照
13． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数
14． 根据标准曲线获得样品总活性对应5-GMP浓度（微摩尔/升）
五、样品非特异活性测定
1． 移取xx微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升HEPENGBIO酶促液（Reagent D）
3． 加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent E）
4． 加入xx微升HEPENGBIO专性液（Reagent J）
5． 上下倾倒数次，混匀
6． 在30℃温度下孵育3分钟
7． 加入5微升待测样品（50微克蛋白）（注意：样品须清澈）
8． 上下倾倒数次，混匀
9． 在30℃温度下孵育30分钟
10． 移取xx微升HEPENGBIO阴性液（Reagent F）
11． 加入xx微升HEPENGBIO终止液（Reagent G），混匀
12． 加入xx微升HEPENGBIO显色液（Reagent H），混匀
13． 室温下静置15分钟，避免光照
14． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品非特异活性读数
15． 根据标准曲线获得样品非特异活性对应5-GMP浓度（微摩尔/升）
六、计算样品活性
（1） 样品总活性和非特异活性计算
（2） 样品特异活性计算
注意事项
1． 本产品为20次（10个样本）操作
2． 操作时，须戴手套
3． 系统操作过程中，标准样品测定只需1次
4． 样品须澄清，至关重要
5． 样品中避免使用EDTA、EGTA、磷酸缓冲液和脱氧胆酸纳处理等
6． HEPENGBIO终止液（Reagent G）和HEPENGBIO显色液（Reagent H）具有腐蚀性，避免直接用手接触
7． 比色测定后，比色皿须清洗彻底
8． 如果用户没有660nm波长，可以使用600至660nm的任一波长替代
9． 显示绿色表明具有较强酶活性
10． 测定值由低到高变化
11． 建议待测样本蛋白浓度为50微克/10微升（本公司提供 HEPENGBIO Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－HEPENGBIO30030.1）
12． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
13． 磷酸二酯酶5单位活性定义为：在30℃，pH 7.4条件下，每分钟内能够水解1纳摩尔环核苷酸（cGMP）至5’-核苷（5’-nucleotides）所需的酶量作为一个活性单位
14． 本公司提供系列磷酸二酯酶检测试剂产品
产品内容
HEPENGBIO清理液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B） 毫升
HEPENGBIO缓冲液（Reagent C） 毫升
HEPENGBIO酶促液（Reagent D） 微升
HEPENGBIO底物液（Reagent E） 微升
HEPENGBIO阴性液（Reagent F） 微升
HEPENGBIO终止液（Reagent G） 毫升
HEPENGBIO显色液（Reagent H） 毫升
HEPENGBIO标准液（Reagent I） 微升
HEPENGBIO专性液（Reagent J） 微升
产品说明书 1份
保存方式
保存HEPENGBIO裂解液（Reagent B）、HEPENGBIO酶促液（Reagent D）、HEPENGBIO底物液（Reagent E）、HEPENGBIO显色液（Reagent H）、HEPENGBIO标准液（Reagent I）和HEPENGBIO专性液（Reagent J）在－20℃冰箱里，避免反复冻融；其余的保存在4℃冰箱里；HEPENGBIO终止液（Reagent G）和HEPENGBIO显色液（Reagent H）具有腐蚀性，避免直接用手接触；HEPENGBIO显色液（Reagent H）避免光照，有效6月
用户自备
1.5毫升离心管：用于样品保存的容器
15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器
（微型）台式离心机：用于样品操作
比色皿或酶标板：用于比色分析的容器
分光光度仪或酶标仪：用于比色分析
实验步骤
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后进行下列操作。
一、 样品准备
1． 手术取出动物组织，并秤重以确定500毫克组织重量
2． （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管
3． （选择步骤）加入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A）清洗1次
4． 移入到一个液氮冻存管
5． 即刻放进液氮罐过夜
6． 次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）
7． 放进一个15毫升锥形离心管
8． 加入置于冰槽里的xx微升HEPENGBIO裂解液（Reagent B）
9． 强力涡旋震荡30秒，充分混匀
10． 放进冰槽里孵育30分钟，期间每10分钟强力涡旋震荡30秒（注意：如需暂时停止，放进－70℃冰箱里储存备用）
11． 即刻放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为10000g
12． 小心移取上清液到新的无菌的1.5毫升离心管
13． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用HEPENGBIO Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－HEPENGBIO30030.1）
14． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、 测定准备
1． 开启并设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长660nm，并置零
2． 从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；HEPENGBIO显色液（Reagent H）避免光照
3． HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度
三、 标准曲线测定
1． 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管
2． 按下表分别加入HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）和HEPENGBIO标准液（Reagent I）到每个离心管，混匀
3． 将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表
| 管号 | HEPENGBIO缓冲液（Reagent C） | HEPENGBIO标准液（Reagent I） | 标准5-GMP浓度 |
| 1 | 0 | xx微升 | xx微摩尔/升 |
| 2 | xx微升 | xx微升1号管 | xx微摩尔/升 |
| 3 | xx微升 | xx微升2号管 | xx微摩尔/升 |
| 4 | xx微升 | xx微升3号管 | xx微摩尔/升 |
| 5 | xx微升 | 0 | 0 |
4． 加入40微升上述配制的标准液到新的比色皿
5． 加入xx微升HEPENGBIO酶促液（Reagent D）
6． 在30℃温度下孵育30分钟
7． 移取xx微升HEPENGBIO阴性液（Reagent F）
8． 加入xx微升HEPENGBIO终止液（Reagent G），混匀
9． 加入xx微升HEPENGBIO显色液（Reagent H），混匀
10． 室温下静置15分钟，避免光照
11． 即刻放进分光光度仪检测：获得吸光读数
12． 重复实验步骤4至11四次
13． 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为吸光单位（A）；横座标（X轴）为标准5-GMP浓度（微摩尔/升）
四、 样品背景测定
1． 移取xx微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入5微升待测样品（50微克蛋白）（注意：样品须清澈）
3． 上下倾倒数次，混匀
4． 在30℃温度下孵育30分钟
5． 移取xx微升HEPENGBIO阴性液（Reagent F）
6． 加入xx微升HEPENGBIO终止液（Reagent G），混匀
7． 加入xx微升HEPENGBIO显色液（Reagent H），混匀
8． 室温下静置15分钟，避免光照
9． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品背景读数
10． 根据标准曲线获得样品背景对应5-GMP浓度（微摩尔/升）
五、 样品总活性测定
1． 移取xx微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升HEPENGBIO酶促液（Reagent D）
3． 加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent E）
4． 上下倾倒数次，混匀
5． 在30℃温度下孵育3分钟
6． 加入5微升待测样品（50微克蛋白）（注意：样品须清澈）
7． 上下倾倒数次，混匀
8． 在30℃温度下孵育30分钟
9． 移取xx微升HEPENGBIO阴性液（Reagent F）
10． 加入xx微升HEPENGBIO终止液（Reagent G），混匀
11． 加入xx微升HEPENGBIO显色液（Reagent H），混匀
12． 室温下静置15分钟，避免光照
13． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数
14． 根据标准曲线获得样品总活性对应5-GMP浓度（微摩尔/升）
五、样品非特异活性测定
1． 移取xx微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升HEPENGBIO酶促液（Reagent D）
3． 加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent E）
4． 加入xx微升HEPENGBIO专性液（Reagent J）
5． 上下倾倒数次，混匀
6． 在30℃温度下孵育3分钟
7． 加入5微升待测样品（50微克蛋白）（注意：样品须清澈）
8． 上下倾倒数次，混匀
9． 在30℃温度下孵育30分钟
10． 移取xx微升HEPENGBIO阴性液（Reagent F）
11． 加入xx微升HEPENGBIO终止液（Reagent G），混匀
12． 加入xx微升HEPENGBIO显色液（Reagent H），混匀
13． 室温下静置15分钟，避免光照
14． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品非特异活性读数
15． 根据标准曲线获得样品非特异活性对应5-GMP浓度（微摩尔/升）
六、计算样品活性
（1） 样品总活性和非特异活性计算
（2） 样品特异活性计算
注意事项
1． 本产品为20次（10个样本）操作
2． 操作时，须戴手套
3． 系统操作过程中，标准样品测定只需1次
4． 样品须澄清，至关重要
5． 样品中避免使用EDTA、EGTA、磷酸缓冲液和脱氧胆酸纳处理等
6． HEPENGBIO终止液（Reagent G）和HEPENGBIO显色液（Reagent H）具有腐蚀性，避免直接用手接触
7． 比色测定后，比色皿须清洗彻底
8． 如果用户没有660nm波长，可以使用600至660nm的任一波长替代
9． 显示绿色表明具有较强酶活性
10． 测定值由低到高变化
11． 建议待测样本蛋白浓度为50微克/10微升（本公司提供 HEPENGBIO Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－HEPENGBIO30030.1）
12． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
13． 磷酸二酯酶5单位活性定义为：在30℃，pH 7.4条件下，每分钟内能够水解1纳摩尔环核苷酸（cGMP）至5’-核苷（5’-nucleotides）所需的酶量作为一个活性单位
14． 本公司提供系列磷酸二酯酶检测试剂产品
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