精子（spermatozoa）分析提供了精子生成（spermatogenesis）、精子寿命、以及生育能力的基础信息。其中精子的活力（vitality）、运动能力（motility）、授精潜力（fertilizing potential）、膜结构或染色质结构完整性（integrity）、顶体反应（acrosomal reaction）功能的评价是精子分析的重要指标，也是决定人工受孕或体外授精（in vitro fertilization；IVF）的重要参数。其中质膜完整性（membrane integrity）是精子授精能力的标志，反映精子膜功能状态。结构完整和功能活化的质膜是精子细胞代谢、获能顶体反应、附着和穿越卵细胞等生理活动所必需的。使用SYBR14和碘化丙啶（Propidium Iodide；PI）双重荧光染色，是精子质膜完整性分析的最常用的方法。首先使用SYBR14染色，基于其可以自由穿越活体且质膜完好的精子细胞，与核内核酸结合的特点，显示质膜完整性。而碘化丙啶受到质膜完整的活体精子细胞（包括游动性和非游动性精子）的排斥，而容易进入破损或死亡精子细胞，表明质膜损伤。双染的作用，以帮助区分质膜结构完整性与否。通过常用的荧光显微镜，便可清晰观察到质膜状态（status）。  
产品内容
HEPENGBIO保存液（Reagent A）  毫升
HEPENGBIO染色液A（Reagent B）  微升
HEPENGBIO染色液B（Reagent C）  微升
产品说明书  1份
保存方式
保存在－20℃冰箱里；HEPENGBIO染色液A和B（Reagent B和C）避免光照，有效保证6月
用户自备
1.5毫升离心管：用于样品操作的容器
微型台式离心机：用于样品染色操作的容器
血细胞计数器：用于细胞计数
载玻片和盖玻片：用于精子细胞爬片
（共聚焦）荧光显微镜：用于观察染色的精子细胞  
实验步骤
1． 移取新鲜获得的1毫升精液（48小时内）到1.5毫升离心管
2． 放进37℃培养箱孵育30分钟
3． 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为600g
4． 小心抽去上清液
5． 加入xx毫升HEPENGBIO保存液（Reagent A），混匀颗粒群
6． 在血细胞计数器上进行精子细胞计数，并调整到2 X 10⁷精子细胞/毫升
7． 移取100微升精子细胞到新的1.5毫升离心管
8． 加入xx微升HEPENGBIO染色液A（Reagent B），混匀
9． 37℃温度下孵育10分钟，避免光照
10． 小心加入xx微升HEPENGBIO染色液B（Reagent E），混匀
11． 37℃温度下孵育10分钟，避免光照
12． 移取50微升到载玻片上
13． 小心抽去染色液
14． 盖上盖玻片
15． 即刻在（共聚焦）荧光显微镜下观察并计数（注意：每个视野计数200个精子）
观察绿色荧光—HEPENGBIO染色液B（Reagent E）：滤波器激发波长490nm，散发波长520nm
观察红色荧光—HEPENGBIO染色液A（Reagent B）：滤波器激发波长：488nm；散发波长：630nm 
16． 分析结果

分类	染色结果	意义
I	整个精子头部呈现明亮绿色荧光	质膜完整（intact）
II	整个或部分精子头部呈现红色荧光	质膜完全损伤（damaged）
III	整个精子头部呈现橘黄色荧光	质膜损伤

 
注意事项
1． 本产品为20次操作
2． 操作时须戴手套
3． 样品检测前，建议在血细胞计数器上进行精子细胞计数
4． 精子细胞计数时乘上稀释倍数10⁴。标准血细胞计数器（Hemocytometer）的计算方法是：
1毫米方块的细胞计数X 10⁴（稀释倍数）＝实际细胞数/毫升
5． 染色完成后，即刻进行检测分析
6． 本公司提供系列发育生物学相关检测试剂产品