糖胺多糖(glycosaminoglycan;GAG),又称为粘多糖(mucopolysaccharide),是体内最为丰富的异源多聚糖。糖胺多糖是一种未分叉的负电荷性长链多聚糖,由重复的二糖单位,包括六碳糖(hexose)或己糖醛酸(hexuronic acid),链接到己糖胺(hexoamine)上而成。糖胺多糖与核心蛋白(core protein)共价相联,构成蛋白多糖(proteoglycan;PG),成为细胞膜和细胞外基质(extracellular matrix;ECM)的主要成分。蛋白多糖的糖胺多糖在合成过程中发生硫酸酯化(sulfated group),其部位在O或N位上,有利于发挥各种不同的作用,包括酶的调节、细胞黏附、生长、迁移、分化,以及组织损伤反应。基于糖胺多糖的高度负电荷的特点,使用异染性(metachromatic)阳离子蓝色染料二甲基亚甲基蓝(1,9-dimethylmethylene blue;DMMB),在酸性条件下,特异性的结合产生不溶性紫色或粉红色糖胺多糖染料复合物(Dye-GAG complex),在丙醇解离溶液中,释放出染料,通过分光光度仪(656nm波长)测定,来定量分析糖胺多糖的总含量。
产品内容
HEPNGBIO清理液(Reagent A) 毫升
HEPNGBIO萃取液(Reagent B) 毫升
HEPNGBIO染色液(Reagent C) 毫升
HEPNGBIO解离液(Reagent D) 毫升
HEPNGBIO标准液(Reagent E) 微升
产品说明书 1份
保存方式
保存HEPNGBIO萃取液(Reagent B)在-20℃冰箱里;其余的保存在4℃冰箱里;HEPNGBIO染色液(Reagent C)避免光照;有效保证6月
用户自备
1.5毫升离心管:用于样品操作的容器
15毫升锥形离心管:用于样品操作的容器
恒温水槽或干式恒温仪:用于样品反应
微型台式离心机:用于样品操作
比色皿或96孔板:用于比色分析的容器
分光光度仪或酶标仪:用于比色分析
实验步骤
一、样品预处理
1. 准备好1.5毫升离心管
2. 移取1毫升液体(尿液/脑脊液/唾液/精液/关节液/培养液样品)到离心管
3. 放进4℃微型台式离心机离心10分钟,速度为700g(或3000RPM,例如eppendorf 5415)
4. 小心移取500微升上清液到新的1.5毫升离心管
5. 加入xx微升HEPNGBIO萃取液(Reagent B)
6. 强力涡旋震荡1分钟,充分混匀
7. 放进56℃恒温水槽孵育16小时
8. 放进90℃恒温水槽孵育10分钟
9. 放进微型台式离心机离心10分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415)
10. 小心移取上清液到新的1.5毫升离心管
11. 置于冰槽里备用
二、标准样品配制
1. 准备好5个1.5毫升离心管,标记为1至5号管
2. 分别加入xx微升HEPNGBIO清理液(Reagent A)到1至5号管
3. 移取xx微升HEPNGBIO标准液(Reagent E)到1号管,混匀
4. 小心移取xx微升1号管稀释的HEPNGBIO标准液(Reagent E)到2号管,混匀
5. 小心移取xx微升2号管稀释的HEPNGBIO标准液(Reagent E)到3号管,混匀
6. 小心移取xx微升3号管稀释的HEPNGBIO标准液(Reagent E)到4号管,混匀
7. 将1至5号管放进冰槽里备用;标准管浓度见下表
三、 标准曲线测定
1. 移取xx微升上述配制的HEPNGBIO标准液(Reagent E)到1.5毫升离心管
2. 加入xx毫升HEPNGBIO染色液(Reagent C)
3. 涡旋震荡15秒
4. 室温下孵育30分钟,避免光照,期间每隔5分钟涡旋震荡15秒(注意:可见紫色或粉红色沉淀)
5. 即刻放进微型台式离心机离心10分钟,速度为16000g
6. 小心抽去上清液(注意:确保没有水滴残留)
7. 加入xx毫升HEPNGBIO解离液(Reagent D)
8. 涡旋震荡15秒
9. 室温下孵育5分钟,避免光照(注意:确保充分溶解)
10. 转移到新的比色皿
11. 即刻放进分光光度仪检测(波长656nm):获得标准样品吸光读数
12. 重复实验步骤1至11四次
13. 构建标准曲线:纵座标(Y轴)为吸光读数;横座标(X轴)为标准糖胺多糖含量(微克)
四、 样品测定
1. 加入50微升上述制备的待测样品到1.5毫升离心管
2. 加入xx毫升HEPNGBIO染色液(Reagent C)
3. 涡旋震荡15秒
4. 室温下孵育30分钟,避免光照,期间每隔5分钟涡旋震荡15秒(注意:可见紫色或粉红色沉淀)
5. 即刻放进微型台式离心机离心10分钟,速度为16000g
6. 小心抽去上清液(注意:确保没有水滴残留)
7. 加入xx毫升HEPNGBIO解离液(Reagent D)
8. 涡旋震荡15秒
9. 室温下孵育5分钟,避免光照(注意:确保充分溶解)
10. 转移到新的比色皿
11. 即刻放进分光光度仪检测(波长656nm):获得样品吸光读数
12. 根据上述标准曲线获得样品对应糖胺多糖含量(微克)
产品内容
HEPNGBIO清理液(Reagent A) 毫升
HEPNGBIO萃取液(Reagent B) 毫升
HEPNGBIO染色液(Reagent C) 毫升
HEPNGBIO解离液(Reagent D) 毫升
HEPNGBIO标准液(Reagent E) 微升
产品说明书 1份
保存方式
保存HEPNGBIO萃取液(Reagent B)在-20℃冰箱里;其余的保存在4℃冰箱里;HEPNGBIO染色液(Reagent C)避免光照;有效保证6月
用户自备
1.5毫升离心管:用于样品操作的容器
15毫升锥形离心管:用于样品操作的容器
恒温水槽或干式恒温仪:用于样品反应
微型台式离心机:用于样品操作
比色皿或96孔板:用于比色分析的容器
分光光度仪或酶标仪:用于比色分析
实验步骤
一、样品预处理
1. 准备好1.5毫升离心管
2. 移取1毫升液体(尿液/脑脊液/唾液/精液/关节液/培养液样品)到离心管
3. 放进4℃微型台式离心机离心10分钟,速度为700g(或3000RPM,例如eppendorf 5415)
4. 小心移取500微升上清液到新的1.5毫升离心管
5. 加入xx微升HEPNGBIO萃取液(Reagent B)
6. 强力涡旋震荡1分钟,充分混匀
7. 放进56℃恒温水槽孵育16小时
8. 放进90℃恒温水槽孵育10分钟
9. 放进微型台式离心机离心10分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415)
10. 小心移取上清液到新的1.5毫升离心管
11. 置于冰槽里备用
二、标准样品配制
1. 准备好5个1.5毫升离心管,标记为1至5号管
2. 分别加入xx微升HEPNGBIO清理液(Reagent A)到1至5号管
3. 移取xx微升HEPNGBIO标准液(Reagent E)到1号管,混匀
4. 小心移取xx微升1号管稀释的HEPNGBIO标准液(Reagent E)到2号管,混匀
5. 小心移取xx微升2号管稀释的HEPNGBIO标准液(Reagent E)到3号管,混匀
6. 小心移取xx微升3号管稀释的HEPNGBIO标准液(Reagent E)到4号管,混匀
7. 将1至5号管放进冰槽里备用;标准管浓度见下表
管号 | HEPNGBIO清理液(Reagent A) | HEPNGBIO标准液(Reagent E) | 标准糖胺多糖含量 |
1 | xx微升 | xx微升 | xx微克 |
2 | xx微升 | xx微升1号管 | xx微克 |
3 | xx微升 | xx微升2号管 | xx微克 |
4 | xx微升 | xx微升3号管 | xx微克 |
5 | xx微升 | 0 | 0 |
三、 标准曲线测定
1. 移取xx微升上述配制的HEPNGBIO标准液(Reagent E)到1.5毫升离心管
2. 加入xx毫升HEPNGBIO染色液(Reagent C)
3. 涡旋震荡15秒
4. 室温下孵育30分钟,避免光照,期间每隔5分钟涡旋震荡15秒(注意:可见紫色或粉红色沉淀)
5. 即刻放进微型台式离心机离心10分钟,速度为16000g
6. 小心抽去上清液(注意:确保没有水滴残留)
7. 加入xx毫升HEPNGBIO解离液(Reagent D)
8. 涡旋震荡15秒
9. 室温下孵育5分钟,避免光照(注意:确保充分溶解)
10. 转移到新的比色皿
11. 即刻放进分光光度仪检测(波长656nm):获得标准样品吸光读数
12. 重复实验步骤1至11四次
13. 构建标准曲线:纵座标(Y轴)为吸光读数;横座标(X轴)为标准糖胺多糖含量(微克)
四、 样品测定
1. 加入50微升上述制备的待测样品到1.5毫升离心管
2. 加入xx毫升HEPNGBIO染色液(Reagent C)
3. 涡旋震荡15秒
4. 室温下孵育30分钟,避免光照,期间每隔5分钟涡旋震荡15秒(注意:可见紫色或粉红色沉淀)
5. 即刻放进微型台式离心机离心10分钟,速度为16000g
6. 小心抽去上清液(注意:确保没有水滴残留)
7. 加入xx毫升HEPNGBIO解离液(Reagent D)
8. 涡旋震荡15秒
9. 室温下孵育5分钟,避免光照(注意:确保充分溶解)
10. 转移到新的比色皿
11. 即刻放进分光光度仪检测(波长656nm):获得样品吸光读数
12. 根据上述标准曲线获得样品对应糖胺多糖含量(微克)